高效液相色譜實驗技術問題解答

　　高效液相色譜以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測。

　　1、高效液相色譜是如何實現(xiàn)高效、快速、靈敏的? 解：氣相色譜理論和技術上的成就為液相色譜的發(fā)展創(chuàng)造條件，從它的高效、高速和高靈敏渡得到啟發(fā)，采用5一10四微粒出定相以提高柱效，采用高壓泵加快液體流動相的流速;設計高靈敏度、死體積小的紫外、熒光等檢測器，提高檢測靈敏度，克服經典液相色譜曲缺點，從而達到高效、快速、靈敏。

　　2、與氣相色譜法相比高效液相色譜有哪些優(yōu)點和不足? 解：氣相色譜的分析對象是在校溫下具有一定的揮發(fā)性、對熱穩(wěn)定購物質。因此它只限于分析氣體和沸點低的化合物或揮發(fā)性的衍生物。而高效液相色譜由于以液體作為流動相，只要被分析的物質在選用的流動相中有一定的按解度，便可以分析，所以適用性廣，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，特別適合于那些沸點高、極性強、熱穩(wěn)定性差的化合物，例如，生化物質和藥物、離子型化合物、熱穩(wěn)定性差的天然產物等。在目前已知的有機化臺物中， 只有20%樣品可不經化學處理而能滿意地用氣相色譜分離，80%的有機化合物要用高效液相色譜分析。

　　氣相色譜中流動相是惰性的，它對組分沒有作用力，僅起運載作用、而高效液相色譜的流動相不僅起運載作用，而且流動相對組分有一定親合力，可以通過改變流動相種類和組成提高分離的選擇性，另外可作流動相的化合物多，選擇余地廣。

　　與氣相色譜相比，高效液相色譜的另一個優(yōu)點是樣品的回收比較容易，只要開口容器放在柱子末端，就可以很容易地將所分離的各組分收集�；厥帐嵌�量的，可以用來提純和制備具有足夠純度的單一物質。

　　高效液相色譜不足的是，日前檢測器的靈敏度不及氣相色譜。必須特別注意“柱外效應”對柱效率及色譜分離的影響。

　　3、試比較氣相色譜與液相色譜的H-u曲線，分析產生不同的原因。

　　解：從圖可看出，氣相色譜和液相色譜得到的H-u曲線，形狀迥然不同，流動相的流速對柱效的影響也不一樣，在氣相色譜的H-u曲線上，塔板高度H隨u變化呈雙曲線.曲線有一最低點，這時柱效最高，板高最小，流速最佳。而液相色譜H-u曲線，未出現(xiàn)流速降低板高增加的現(xiàn)象，由于最佳流速趨近于零，一般觀察不到最低板高相對應的最佳流速。在正常的情況下，流速降低，板高H總是降低的，這與氣相色譜明顯不同。在氣相色譜中流動相流速增大，柱效呈直線降低，而在液相色譜中，流動相流速增大，柱效平緩降低。其主要原因是液相色譜的流動相為液體，液相的擴散系數(shù)Dm很小，通常僅為氣相擴散系數(shù)的104~105分之一，所以分子擴散項在低u時也不起多大作用、因此液相色譜H-u曲線未能出現(xiàn)流速降低，板高增加現(xiàn)象。到高速時，雖然柱內線速提高，但固定相和流動相的傳質都能很快進行，故H-u曲線上升緩慢。

　　4、簡述液相色譜中引起色譜峰擴展的主要因素，如何減少諳帶擴張、提高柱效? 解：液相色譜中引起色諾峰擴展的主要因素為渦流擴散、流動相傳質、停留流動相傳質及柱外效應。

　　在液相色譜中要減小譜帶擴張，提高柱效，要減少續(xù)料顆粒直徑，減小境料孔穴深度，提高裝填的均勻性，采用低粘度溶劑作流動相，流速盡可能低，同時要盡可能采用死體積較小的進樣器、檢測器、接頭和傳輸管線等。

　　5、為什么要提出折合參數(shù)?有何特點? 解：我們知道色譜操作條件對板高是有影響的.Giddings發(fā)現(xiàn)，固定相相同，填充良好，共是粒度dp不同，因而H-u曲線不同，在液相色譜中，培板高度是粒度的函數(shù)，為了比較不向色譜條件下的板高H.提出折合參數(shù)，包括折合板高、折合流速、折合柱長。其特點是對于不同粒度的填料能得到相同的H—ur 曲線，因此可以在相同的條件下比較不同填料的柱效。

　　6、色譜柱A長度為15cm，載體粒度為5m.另一B柱長為30cm，載體粒度為10m，兩柱的柱效相等嗎? 解：A柱的折合柱長為30000，B柱的折合柱長也為30000，表明組分在兩根柱內從柱人口到出口都經過30000個載體顆粒.兩校的柱效相等。

　　7、何謂梯度淋洗，適用于哪些樣品的分析?與程序升溫有什么不同? 解：梯度淋洗就是在分離過程中.讓流動相的組成、極性、pH值等按‘定程序連續(xù)變化。使樣品中各組分能在最佳的k下出峰。使保留時間短、擁擠不堪、甚至重疊的組分，保留時間過長而峰形扁平的組分獲得很好的分離，特別適合樣品中組分的k值范圍很寬的復雜樣品的分析。梯度淋洗十分類似氣相色譜的程序升溫，兩者的目的相同。不同的是程序升溫是通過程序改變柱溫。而液相色譜是通過改變流動相組成、極性、pH值來達到改變k的目的。

　　8、流動相為什么要預先脫氣?常用的脫氣方法有哪幾種? 解：流動相中溶解氣體存在以下幾個方面的害處，氣泡進入檢測器，引起光吸收成電信號的變化，基線突然跳動，干擾檢測;溶解在溶劑中的氣體進入色譜柱時，可能與流動相或固定相發(fā)生化學反應;溶解氣體還會引起某些樣品的氧化降解.對分離和分析結果帶來誤差。因此，使用前必須進行脫氣處理。常用的脫氣法有以下幾種：(1)加熱脫氣法;(2)抽吸脫氣法;(3)吹氦脫氣法;(4)超聲波振蕩脫氣法。

　　9、按固定相孔徑大小分類，液相色譜固定相有哪幾類?各有什么特性及適用范圍? 解：從固定相的孔隙深度考慮，液相色譜固定相分為表面多孔型(薄殼型)和全多孔型(全孔型)兩類。

　　表面多孔型固定相多孔層厚度小.孔淺，相對死體積小，出峰迅速，柱效高，顆粒較大，滲透性好，由于孔淺，梯度淋洗時，當流動相成分改變后.孔內外流動相成分能迅速達到平衡，機械強度高，裝柱容易，其不足的是由于多孔層厚度小，因而柱容量小，最大允許樣品量受到限制，適用于比較簡單的樣品分析及快速分析。

　　全多孔型固定相，由于顆粒很細，孔仍然很淺.傳質速度較快，柱效高。梯度淋洗時孔內外流動相成分的平衡速度仍然較快.其最大特點是柱容量大，最大允許樣品量是表面多孔型的5倍，但裝填的什于滲透性低，因而需要更高的操作壓力.制柱比表面多孔型的難。這種固定相特別有利于痕量組分及多組分復雜混合物的分離分析。

　　10、什么叫化學鍵合色譜? 與液—液色譜相比有何優(yōu)點? 解：通過化學反應，將固定液鍵合到載體表面，此種固定相稱為化學鍵合固定相;采用化學鍵合固定相的色譜法，稱為化學鍵合色譜。

　　與液—液分配色譜相比，鍵合色譜法的主要優(yōu)點：(1)化學鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用過程中不流失。(2)適宜用梯度淋洗。(3)適合于k范圍很寬的樣品。(4)由于鍵合到載體表面官能團，既可是非極性的，也可是極性的，因此應用面廣。

　　11、(選擇題)在液相色譜中，常用作固定相合相基體的物質是 A.分子篩 B.硅膠 c氧化鋁 D.活性炭 解：B.硅膠。

　　要形成化學鍵合固定相，所用的基質材料應有某種化學反應活性，在四種固體固定相中只有硅膠合有硅醇基，是能進行鍵合的活性官能團。

　　12、高效液相色譜柱有哪幾種類型? 細徑柱有什么優(yōu)點? 解：高效液相色譜拄大致可分為三種類型：內徑小于2mm的稱為細管徑或微管徑柱;內徑在2~5mm范圍內的是常規(guī)高效液相色譜柱;內徑大于5mm的一般稱為半制備柱或制備柱。細管徑柱的主要優(yōu)點是：(1)分離效能高。(2)流動相最佳流速低，消耗量少。(3)可采用多種檢測器，便于聯(lián)用(CLC MS，CLC-FTIR)。(4)采用細而短的毛細管柱可以提高分析速度，實現(xiàn)快速分析。

　　13、什么叫反相色譜?試從固定相、流動相、流出次序、流動相極性的影響等幾個方面比較正相和反相的區(qū)別。

　　解：流動相的極性比固定相的極性強的色譜體系叫反相色譜。例如以十八烷基硅膠鍵合相(ODS)為固定相，以甲酵/水作流動相，是典型的反相色譜。正相色譜和反相色譜這兩種操作模式的主要區(qū)別見下表： 正相和反相色譜的區(qū)別 比較項目正相色譜反相色譜 固定相 流動相 流出次序 流動相極性的影響極性 非(弱)極性 極性組分k大 極性增加，k減小非(弱)極性 極性 極性組分k小 極性增加，k增大 14、對液相色譜流動相有何要求? 解：用作液相色譜流動相的溶劑，其純度和化學特性必須滿足色譜過程中穩(wěn)定性和重復性的要求。對樣品要有一定的溶解能力，粘度小，化學穩(wěn)定性好，避免發(fā)生不可逆的化學吸附。溶劑應與檢測器相匹配，不干涉所使用檢測器的工作，制備色譜的溶劑應不干擾對分離各組分的回收。除此以外，選擇的溶劑對所給定的樣品組分具有合適的極性和良好的選擇性。

　　15、在150×2mm硅膠柱流動相為已烷/甲醇(150：2)，紫外檢測器色譜條件下分離丙烯酰胺，判斷以下組分的出峰次序，為什么? 解：在給定的色譜條件下，組分B先出峰，組分A后出峰。以硅膠為固定相，己烷/甲醇(150：2)為流動相，該體系為正相色譜，樣品的極性A>B，在正相色譜體系極性小的組分先出峰，極性大的組分后出峰，所以出峰次序為B先出，A后出。

　　16、在硅膠往上，用甲苯為流動相，某組分的保留時間為30min，如果改用四氯化碳或乙醚為流動相，試指出選用哪一種溶劑能減少該組分的保留時間? 為什么? 解：該體系為正向色譜體系。在該體系中流動相的極性增大保留值減小。流動相甲苯、四氯化碳及乙醚的溶劑強度參數(shù)分別是0.29、0.18、0.38，因此選用溶劑強度參數(shù)大于甲苯的乙醚，可縮短該化合物的保留時間。

　　17、在高效液相色譜中，組分和溶劑分子之間存在哪幾種作用力? 解：存在色散力、偶極作用、氫鍵作用和介電作用等四種作用力。

　　18、什么是溶劑極性參數(shù)與溶劑強度? 它們之間的關系如何? 解：溶劑分子與溶質分子以色散力、偶極作用力、氫鍵作用力及介電作用力四種方式進行相互作用的能力稱為分子的“極性”，溶劑的這種能力以溶劑極性參數(shù)P’表示，P’值越大，溶劑的極性越強。

　　溶劑強度指用作流動相的溶劑，將組分從色譜柱上洗脫下來的能力。

　　溶劑強度直接與溶劑的極性有關，而且隨不同色譜體系而變，在正相色譜體系中，溶劑極性增加，使組分從柱上洗脫下來的能力增加，即P’越大的溶劑，溶劑強度越大。在反相色譜中，溶劑極性減小，使組分從柱上洗脫下來的能力增加，即P’越小的溶劑，溶劑強度越大。

　　19、預測在正相色譜與反相色譜體系中，組分的出峰次序。

　　解：在正相色譜體系中組分的出峰次序為：極性弱的組分，在流動相中溶解度較大，因此k值小，先出峰。極性強的組分，在固定相中的溶解度較大，因此k值大，后出峰。

　　在反相色譜中組分的出峰次序為：極性弱的組分在固定相上的溶解度大，k值大，后出峰，相反極性強的組分在流動相中溶解度大，k值小，所以先出峰。

　　20、在ODS固定相上，以甲醇為流動相，某組分的分配容量k1=1.2，如以乙腈為流動相，其k增加還是減少? 為什么? 解：據(jù)題意為反相色譜體系。

　　k值增加，在反相色譜體系中，流動相由甲醇變?yōu)橐译妫�溶劑極性參數(shù)由5.1變?yōu)?.8，增加了，但組分在流動相中的溶解度反而減小，所以k值增大。由1.2增大為2.24。

　　21、在反相色譜中，流動相從40%(V/V)甲醇—水改變?yōu)?0%(V/V)甲醇—水，問組分的調整保留值將改變多少? 為什么? (P’ 甲醇=5.1，P’ 水=5.1)

　　提示：對于由溶劑A和B組成的二元混合溶劑，其極性可表示為 Pab ‘=a P a’ b P b’ 式中a和b分別為溶劑A和B在混合溶劑中的分數(shù)。

　　解：在40%配比時，混合溶劑的極性為 P1’ =0.46×5.1 0.6×10.2=8.16 在60%配比時，混合溶劑的極性為 P2’ =0.6×5.1 0.4×10.2=7.14 P2’= P2’- P2’=7.14-8.16= -1.02 根據(jù)反相色譜體系 ∴在反相色譜中，流動相的極性變弱(P’由8.16變?yōu)?.14)，溶劑強度增加，洗脫能力增加，因而使組分的調整保留時間減少到原來的1/3.2。

　　22、某色譜體系采用25%三氯甲烷/正己烷為流動相，發(fā)現(xiàn)組分分離不十分理想，想通過改變流動相的選擇性來改善分離選擇性，選用乙醚/正己烷為流動相，問乙醚/正己烷的比例為多少? (P’ CHCl3=5.1，P’乙醚=5.1)

　　提示：流動相選擇性的改變是通過保持溶劑強度不變時改變流動相組成來實現(xiàn)的，改變前流動相A/B和改變后的流動相A/C的組成有下列關系： 解：25%的CHCl3/正己烷與37%乙醚/正己烷的溶劑強度相等，但對樣品的分離選鋒性不同。

　　23、什么叫離子色譜? 解：在低交換容量的分離柱上，分離樣品離子，而在高交換容量的抑制柱上，通過化學反應，把具有高電導的流動相轉變?yōu)榈碗妼У牧鲃酉�，這樣就可以在電導檢測器上對被分離樣品離子進行高靈敏度的檢測。這種采用分離柱、抑制柱和電導檢測器相結合的離子交換色譜稱為離子色譜。

　　24、為什么凝膠色譜中任何組分的分配系數(shù)必須符合0≤K≤1?如果K>l說明什么問題? 解：因為組分的分配系數(shù)為K=Cs/Cm ，C s與Cm分別為組分在固定相和流動相中的濃度，當分子直徑大于固定相孔徑時，此時Cm=0，∴K=0。當分子直徑小于孔徑時，組分向孔隙內流動相擴散，達到平衡時，一半組分在孔隙內，一半在孔隙外，此時K=1.0，若分子直徑介于以上兩種極限情況之間，K一定介于0與1之間.可見在凝膠色譜中，任何組分的分配系數(shù)為0≤K≤1，如果K>1，這說明此時的分離方式已不是純粹的凝膠色譜，其分離過程受到其他作用力(如吸附)的支配。

　　25、某人用凝膠色譜分離一高聚物樣品，分離情況很差，他改變流動相的組成后，分離情況大為改進，這種說法對嗎? 為什么? 解：這種說法不對。在凝膠色譜中流動相只起運載的作用，不能依靠改變流動相的性質和組成來改善色譜體系的選擇性。凝膠色譜的選擇性只能通過選擇合適的固定相，根據(jù)固定相孔隙的大小以及孔徑分布范圍的最佳化來實現(xiàn)。題目中“改變流動相組成后，分離情況大為改進”是不可能的。

　　26、(選擇題)液相色譜中通用型檢測器是 A.紫外吸收檢測器 B.示差折光檢測器 C熱導池檢測器 D.熒光檢測器 解：B.示差折光檢測器。

　　A、D為選擇性檢測器，C為氣相色譜中通用檢測器。

　　27、為了測定鄰氨基苯酚中微量雜質苯氨，現(xiàn)有下列固定相：硅膠、ODS鍵合相，下列流動相：水—甲醇、異丙醚—己烷，應選用哪種固定相、流動相? 為什么? 解：鄰氨基苯酚中微量雜質苯氨測定，為了良好分離，應讓苯氨先出峰，由于苯氨的極性小于鄰氨基苯酚，因此應采用正相色譜法，應選硅膠為固定相，異丙醚—己烷為流動相。

　　28、在ODS鍵合固定相，甲醇—水為流動相時試判斷四種苯并二氮雜苯的出峰順序。為什么? 解：色譜條件為反相鍵合色譜體系，在反相色譜體系中極性大的組分k小，首先出峰，按四種苯并二氮雜苯的結構，出蜂順序為4—3—2—1。

　　29、用多孔凝膠為固定相，流動相為四氫呋喃，分離以下各組分，試判斷各組分的出蜂順序。為什么? 解：凝膠色譜組分的出峰次序是根據(jù)分子尺寸大小，大的先出峰.故出峰次數(shù)為n=9、8、7。

　　30、分離含胺類和季銨接的樣品，以0.2M HClO4溶液為固定相，以丁醇—二氯甲烷—己烷為流動相，已知組分A的保留時間為8.2min，死時間為1.0min.在另一根柱上.其他條件均不改變，只將HClO4的濃度增加一倍，間組分A在第二根柱上的移動速率，是在第一根柱上的幾倍? 解：從題意分析知，該題分離類型是正相離子對色譜，因此K與KBP的關系為： A在第二根柱上的移動速率是第一根柱的1.78倍。