常規(guī)切片制備的注意事項

　　1 . 取材

　　取材的好壞，直接影響切片的質(zhì)量。醫(yī)生在取材時，首先要有一把鋒利的取材刀，在切割組織時要避免取材刀來回拖拉，切取的組織塊厚薄要均勻，一般厚度以0.2

　　～0.3cm為適，較容易發(fā)脆的組織如甲狀腺、肝臟、血塊、淋巴結(jié)、大塊癌組織等可適當(dāng)厚一點，而脂肪組織、肺組織、纖維性腫瘤、平滑肌瘤等致密的或試劑不易滲入的組織應(yīng)取薄一些;淋巴結(jié)應(yīng)修掉兩側(cè)球冠，并盡量剔除周圍的脂肪組織。在取材中還應(yīng)十分注意組織內(nèi)是否有縫線或骨組織，如碰到不可避免的鈣化組織，應(yīng)與技術(shù)室講明，在切取纖維組織、肌肉組織、胃腸道時，應(yīng)注意纖維及肌肉的走向，取材時盡可能按與纖維平行走向切取為佳。

　　2 . 固定

　　固定是技術(shù)室工作的第一步，也是在整個制片過程中無法補救的一步。所謂“固定”，就是組織離體后，用各種辦法使其細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)盡量接近其生活狀態(tài)時的形態(tài)結(jié)構(gòu)和位置的過程。固定的目的是為了防止組織細(xì)胞自溶與腐敗，防止了細(xì)胞內(nèi)的酶對蛋白質(zhì)的分解作用，使細(xì)胞內(nèi)的各和成分如蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物或酶類轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持原有的結(jié)構(gòu)與生活時相仿。另外，組織固定后，均呈一定的硬化狀態(tài)，增加組織韌性，而且不易變形，有利于以后的組織處理。所以組織一旦離體必需及時固定，固定液的量應(yīng)為組織的5倍。固定的關(guān)鍵主要與固定的及時性、固定液的選擇、固定液的濃度、固定的溫度和時間有關(guān)。最常用的固定液為10%福爾馬林。筆者認(rèn)為，10%福爾馬林由于受到福爾馬林的質(zhì)量、使用時的揮發(fā)和取材時帶入的水分影響，濃度被降低致組織固定不足，而高濃度的福爾馬林，降低了對組織的穿透性，形成周圍固定好而中央固定不到的現(xiàn)象。通過實踐，本人認(rèn)為以酸性12～15%的福爾馬林最佳。大標(biāo)本(2cm厚)一般需要6～12個小時，小標(biāo)本一般需要3～6個小時;當(dāng)室溫低18℃時，可在37℃以下的溫箱內(nèi)加溫4～6個小時。由于HE染色最佳著色PH為3.5～4.5,

　　中性福爾馬林對蘇木素染色有一定影響,細(xì)胞核容易發(fā)灰,核染色質(zhì)不佳。

　　所以,

　　盡管中性福爾馬林對抗原有很好的保存作用，但酸性福爾馬林對絕大多數(shù)抗原來說也有很好的保存作用，所以在沒有特別處理的情況下常規(guī)HE用12～15%酸性福爾馬林也可以(每100毫升12～15%福爾馬林液內(nèi)加5毫升冰醋酸)。骨髓、結(jié)締組織固定以Bouin液為佳，經(jīng)Bouin液固定后的組織必須流水沖洗4小時以上。有條件的單位可根據(jù)不同要求選用二種或二種以上的固定液;少數(shù)單位還可建立組織冷凍庫，以便適應(yīng)各種特殊的處理要求。

　　3. 水洗

　　固定后水洗(10～20分鐘)，通常被很多人所忽視，而水洗不徹底，容易造成脫片和染色不鮮艷。對需做免疫組織化學(xué)的組織，更不應(yīng)當(dāng)忽視。福爾馬林不利于組織塊內(nèi)抗原的保存

　　4 . 脫水和透明

　　所謂脫水就是利用脫水劑將組織內(nèi)的水分置換出來，以利于有機溶劑的滲入，這一過程稱為脫水。脫水是否徹底，直接關(guān)系到組織是否能充分透明，而脫水過度(原因是組織在純酒精內(nèi)時間過久，發(fā)生組織質(zhì)地發(fā)生變化)容易造成組織發(fā)脆。造成組織發(fā)脆的原因還有加溫(溫度超過35℃)、脫水劑內(nèi)加有丙酮、浸蠟用的石蠟中二甲苯過多等等。一般我們總認(rèn)為組織發(fā)脆跟高濃度酒精有關(guān)，而忽視了與低濃度的酒精關(guān)系，其實低濃度的酒精具有強大的穿透力，比純酒精更容易滲透到組織塊內(nèi)部使之脫水，組織如果在低濃度酒精里充分脫水，在高濃度酒精里只需脫去從低濃度到高濃度之間的水份，因此，僅需短時間就可完成，如果這時不縮短純酒精的時間，便會引起組織發(fā)脆;如果脫水時加溫，使用丙酮，還可引起組織收縮，并影響免疫組織化學(xué)的標(biāo)記。為了使石蠟浸入到組織塊內(nèi)，必須經(jīng)過一種既能與脫水劑混合，又能與石蠟相溶的媒介物質(zhì)，這個過程稱透明。目前最好的透明劑是二甲苯。很多人認(rèn)為二甲苯極容易使組織發(fā)脆，這個觀點很片面，在常溫下，如果不是時間過長(超過24小時以上)二甲苯并不會引起組織過份發(fā)脆，相反會使某些組織結(jié)構(gòu)比較質(zhì)韌的組織：比如子宮肌瘤等相當(dāng)好切)，但是當(dāng)二甲苯溫度超過35℃以后，極易引起組織發(fā)脆。所以本人認(rèn)為，大小標(biāo)本最好分開脫水，一般情況下，大標(biāo)本脫水時間(室溫18℃)以80%酒精2小時、95%酒精(2道)各1個半小時至2小時、純酒精(3道)各1個半小時至2小時，二甲苯(2道)各30-60分鐘為宜;小標(biāo)本脫水時間應(yīng)相應(yīng)縮短。脫水時間長短，與室溫高低有密切的相關(guān)。我們在實踐中發(fā)現(xiàn)，室溫在12～15℃時，可作為一個臨界溫度范圍。當(dāng)室溫高于此溫度范圍時，組織容易脫水，可適當(dāng)縮短脫水時間;而室溫低于該溫度范圍時，應(yīng)適當(dāng)延長脫水時間(如能保證在一個恒定的溫度下最佳)。更換試劑，應(yīng)以量為基礎(chǔ)，定量更換，不能等到切片不好時再去更換。否則，至少會有2～3批組織切片不好。根據(jù)我科經(jīng)驗，如試劑用量為500ml，每500個蠟塊更換一次為宜。

　　5. 浸蠟

　　組織透明后，在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過程稱為浸蠟。用其他浸透劑(如火棉膠、明膠等)滲入組織內(nèi)部的過程可稱為浸透或透入。浸蠟溫度過高(超過60℃)，在蠟內(nèi)加入二甲苯蠟或由于透明時帶進的二甲苯過多，都會導(dǎo)致組織發(fā)硬，還會使組織內(nèi)的抗原受到破壞;所以作者主張浸蠟用的石蠟熔點在56℃(三道)，第一道：石蠟30分鐘;第二道：石蠟90分鐘;第三道：石蠟，90分鐘。浸蠟溫度控制在56～58℃左右。(第一道也可用硬脂酸石蠟1：3混合浸蠟，不僅可軟化組織，特別適用于比較韌、硬的組織，而且由于硬脂酸是弱酸性的，對細(xì)胞核有媒染作用，核漿比鮮明，但容易脫片;同時對疏松組織容易散片)。有條件的可以每天打開第一道石蠟的蓋子，讓二甲苯揮發(fā)。浸蠟所用的石蠟如有雜質(zhì)盡可能過濾，以防附在組織上，造成切片刀刀口受損，或切片破碎和劃痕增多。

　　6. 包埋

　　用包埋劑來支持組織的過程稱包埋。最常用的是石蠟包埋法。包埋的關(guān)鍵一是平整，二是方位。要求在包埋時，應(yīng)采用鑷子輕壓組織塊拱起部份，使之平貼于底部，通常采用組織的最大面包埋。囊壁、管腔組織應(yīng)豎直包埋。小塊多顆組織，應(yīng)盡量放在一起，并保證在一個平面上。修去兩邊的余蠟(所謂的兩邊，指切片時與切片刀垂直的兩側(cè))。包埋時還應(yīng)注意有無縫線，紙絮，如有一定要去除。胃黏膜活檢標(biāo)本，不能按一般的規(guī)律取最大包埋面，應(yīng)采取窄面豎起包埋。包埋的蠟更應(yīng)過濾，留有雜質(zhì)的石蠟，容易造成污染或刀口受損。蠟的熔點應(yīng)在56～58℃之間選擇，不提倡在冬天使用軟蠟。因為用軟蠟包埋的蠟塊，到了夏天，會粘在一起，不利于資料的保存，而且即使在冬天，用硬蠟包埋的蠟塊也比用軟蠟包埋的蠟塊要好切。

　　7. 磨刀

　　要想切好一張切片，首先要有一把鋒利的切片刀。磨刀是從事切片技術(shù)人員的一項最基本技術(shù)，刀磨的好壞，直接關(guān)系到切片的質(zhì)量。磨刀的手法各人不同，但都要求用力均勻，使刀口和磨刀石全面接觸，兩手的用力點應(yīng)在刀口上，而不是在刀背上。切片刀應(yīng)用一次磨一次，每次僅需10～15分鐘，過長時間的磨刀，容易把已經(jīng)磨出的鋒刃磨掉，檢查切片刀是否鋒利，用手試摸刀口的方法并不十分科學(xué)，不僅不能證明切片刀是否真正鋒利，而且容易損害刀口，最簡單的辦法是每次磨好后拿一個蠟塊試切一下。每次磨好刀后，應(yīng)將磨刀石用蓋子蓋好，以防灰塵掉在磨刀石上，用有灰的磨刀石磨刀，會使切片刀產(chǎn)生許多細(xì)小的缺口�，F(xiàn)在很多單位都買了磨刀機，磨刀機用來開刀鋒和磨缺口的確不錯，但由于磨刀的角度和時間不易精確掌握，故效果并不理想。根據(jù)我們的經(jīng)驗，真正的鋒刃很難用機器磨出來。一次性刀片在很大程度上解決了這個問題。如用一次性刀片，必須及時更換刀口。一個刀口切小標(biāo)本不應(yīng)超過20～25只蠟塊，切大標(biāo)本不應(yīng)超過10～15只蠟塊。

　　8. 切片

　　切片的第一步必需粗切。粗切的厚度大約在50～100微米左右，質(zhì)地較硬的組織或較小的組織應(yīng)再薄一些，粗切致組織全部暴露后，才進行細(xì)切。細(xì)切至組織塊表面均勻一致，無白點后，再把切的蠟片放入溫水中。切片時要求用力均勻、柔和，搖速不易過快或過慢。過快會導(dǎo)致切片厚薄不均，機器磨損;過慢會使切片增厚。切片厚度一般3～5微米。切片的要求是完整、薄、均勻。切下的片膜其大小形狀應(yīng)與組織塊一致，切片的不完整，常會將重要病變遺漏，導(dǎo)致誤診、漏診。在切片放蠟塊時，應(yīng)注意組織包埋的方向，組織的層次，纖維、肌肉等的走向應(yīng)與切片刀平行，較難切的部分應(yīng)放在上面，如皮膚的表皮，腫塊的包膜，胃腸道的漿膜等，這樣可以減少組織的斷裂現(xiàn)象。操作切片機時應(yīng)用力均勻，避免用力過重。對脫鈣組織、骨髓，以及已知的鈣化組織，應(yīng)選用固定的刀口，以減少其他部位出現(xiàn)缺口的可能性。在使用毛筆展片時要防止筆絲進入刀口，因為每切到一根筆絲，就會增加一個缺口。切片厚度一般為4～6微米，有人認(rèn)為：只要切片機刻度標(biāo)著幾個微米，切出來的片子就是幾個微米。其實不然，當(dāng)切片刀不鋒利，或切片時速度不勻，或切的較慢時，切的片子都會變厚，只有在切片刀十分鋒利、切片勻速的情況下，才能真正保證其厚度。下面是切片時碰到的問題的原因及可能處理的方法：(1)組織發(fā)脆：一般是脫水、透明、浸蠟時間過長、溫度過高，并與組織本身質(zhì)地也有關(guān)，在切片時，邊切邊用嘴向蠟片吹氣，可能會好些。(2)切片卷起，可能是刀不鋒利，或刀鋒在另一面，或刀角度過大，切片太厚等等。(3)蠟片彎曲：可能是刀鋒不均，切片刀未磨直，切片刀與蠟塊不平行。(4)

　　透明、浸蠟時間過長、溫度過高，并與組織本身質(zhì)地也有關(guān)(5)厚薄不均：可能是刀、刀座及蠟塊未夾緊，組織太硬，或切片機主軸太向前，或切片機已磨損。(6)切片出現(xiàn)裂痕：可能是刀有缺口，石蠟內(nèi)有雜質(zhì)，組織內(nèi)有鈣化、骨片或有線結(jié),

　　也可能會有棉紙纖維等。(7)切片不連片，切不下片，切片很厚，或者切片后蠟塊發(fā)白，內(nèi)陷：組織脫水不佳。補救辦法：可先將蠟塊溶解，取出組織，放入加熱水浴的丙酮內(nèi)(80℃)，30～60分鐘，再進行透明浸蠟包埋切片，也許會好一點。

　　9. 展片與撈片

　　展片水溫應(yīng)在42℃至47℃之間，這主要和包埋蠟的熔點有關(guān),水溫過高，會引起組織細(xì)胞散開，水溫過低，切片皺摺無法攤平。包埋蠟中如有二甲苯，也會造成石蠟溶解現(xiàn)象。而用一次性刀片切的片子，一碰到熱水，片子上的皺摺就無法再展開，這有二個方法可以解決：第一、可以在切片時邊切邊向蠟片吹氣，這樣的片子就會非常平整，放到熱水里就會自然展開，比較方便快捷，但這樣的片子會略微厚一點;第二、在切完片子后，先把切片放在30%酒精水溶液中，讓酒精的張力自動把皺摺展開，然后再將切片移到熱水，這樣的片子會較薄;如酒精濃度過高，容易引起切片破碎，出現(xiàn)裂隙，像脂肪之類細(xì)胞間粘附性較小的組織一碰到酒精就會散開，故不能用此法。最后撈片時玻片要干凈，要選擇那些完整、無皺摺的切片，粘貼于玻片中1/3和下1/3的中間。

　　10. 烤片和脫蠟

　　烤片，一般在60℃的溫箱內(nèi)烤片0.5～1小時左右，溫度過高，會引起切片細(xì)胞收縮;時間太短(少于20分鐘)，容易造成脫片。脫蠟也相當(dāng)重要，如果脫蠟不干凈，切片不易著色或著色不勻，所以，脫蠟用的二甲苯要經(jīng)常更換，一般用3道二甲苯，每500ml液體，處理500張切片后更換一次為宜。當(dāng)室溫低于18℃時，必須將切片從溫箱拿出后立即放入二甲苯中脫蠟，或?qū)⒍�甲苯放入溫箱�?nèi)預(yù)熱(37℃左右)脫蠟，最高不得超過60℃。然后經(jīng)高濃度的酒精到低濃度的酒精洗去二甲苯，至水。

　　11. 染色

　　蘇木素染色時間要根據(jù)染料的新舊、溫度、切片的類型而定，一般為5-15分鐘。經(jīng)水略洗后，用鹽酸酒精分化，分化程度必須用顯微鏡控制。分化水洗后，可用溫水或自來水藍(lán)化，并充分水洗(流水沖洗5分鐘以上)，以防鹽酸殘留導(dǎo)致切片褪色。我們不提倡使用堿性溶液(釋氨水、肥皂水等)促藍(lán)，盡管藍(lán)化效果很好，但從實踐的結(jié)果來看，用堿性溶液促藍(lán)的切片不能長期保存，容易褪色。最后入伊紅復(fù)染(5-20秒)。HE染色的關(guān)鍵在于深淺適度，對比鮮明，一般有經(jīng)驗的，肉眼就能判斷，但偶而也會出現(xiàn)失誤，所以用顯微鏡控制是最保險的方法。其關(guān)鍵的步驟在于蘇木素染好后的分化及藍(lán)化過程，在藍(lán)化結(jié)束后，應(yīng)在顯微鏡下觀察細(xì)胞核著色是否合適，核結(jié)構(gòu)是否清晰，胞漿內(nèi)是否有殘留的蘇木素等等。染色理想的切片在顯微鏡下應(yīng)是：細(xì)胞核與細(xì)胞漿應(yīng)藍(lán)紅相映，鮮艷美麗;核漿對比明顯，核膜及核染色質(zhì)顆粒清晰可見。

　　12. 脫水和封片

　　切片脫水應(yīng)從低濃度的酒精到高濃度的酒精，80%酒精1道，95%酒精2道，純酒精2道，(正丁醇1道)，二甲苯2道。濃度低的酒精比濃度高的酒精更容易脫水，但也容易使伊紅退色，故脫水時間可短一點，每道3-5分鐘，純酒精每道10分鐘。為增加酒精與二甲苯的相融性，可在二甲苯前面增加一道正丁醇;石碳酸-二甲苯液也有此效，但用石碳酸時如不洗凈，可引起切片退色，不利于切片久存，故不作推薦。切片經(jīng)二甲苯透明后，用中性樹膠封固。為增加切片的透明度，防止細(xì)胞收縮、龜裂或切片出現(xiàn)黑色結(jié)晶樣小點。所以我們規(guī)定切片必須濕封，不得用溫箱烤干或電吹風(fēng)吹干后干燥封片。在南方冬春、霉雨季節(jié)，封片時要防止口鼻呼出的氣體接觸到切片;在天氣較潮濕的日子里，不宜一次將多張切片取出待封，以免切片“還潮”，形成透明不佳,出現(xiàn)云霧狀水珠。脫水劑的更換也應(yīng)有一定的時間規(guī)定。一般是每500ml液體，處理500張切片后更換一次為宜。封片樹膠不能過稀，封片時樹膠要均勻充滿蓋玻片且樹膠不及外溢為佳。要將組織全部覆蓋，也不能有氣泡。最后，粘貼標(biāo)簽，標(biāo)簽必須貼于玻片左側(cè)，編號書寫清楚，最好能打印。