電泳基礎(chǔ)知識(shí)及電泳分析常用方法

　　電泳是指荷電的膠體顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)。

　　在離子移動(dòng)的物理化學(xué)理論中，按照Debye-Huckel的理論。電泳決定于環(huán)繞每個(gè)離子的離子霧中的擴(kuò)散雙電層。當(dāng)離子的尺寸越大、溶液的離子強(qiáng)度越高時(shí)，這種電泳現(xiàn)象就變得越明顯。所以電泳現(xiàn)象中的表面電勢(shì)和雙電層的因素起著決定性的作用。

　　早期研究發(fā)現(xiàn)，許多生物膠體，如蛋白質(zhì)、酶等有特征的電泳遷移率。此遷移率在很大程度上取決于溶液的pH。因此利用這種電泳特征作為對(duì)物質(zhì)的鑒定引起人們廣泛的興趣。特別在那個(gè)時(shí)候，關(guān)于蛋白質(zhì)和酶的化學(xué)本質(zhì)和物理性質(zhì)還知道得不多。

　　以后，電泳不僅作為一種現(xiàn)象，而且作為一種技術(shù)方法得到不斷發(fā)展。從界面分離到各種區(qū)帶電泳，開(kāi)辟了混合物的電泳分析的可能性。由于電泳性質(zhì)的高度特異性，甚至用結(jié)晶純化的樣品也可在電泳分析中分出兩個(gè)或更多的電泳帶。又由于電泳方法的溫和性，對(duì)不穩(wěn)定的生物大分子的分離純化有時(shí)比其他分離技術(shù)如沉淀、離心、層析等更為方便、可靠，甚至可作為具有一定規(guī)模的制備方法。

　　分析方法：

　　一)醋酸纖維素薄膜電泳

　　醋酸纖維素是提纖維素的羥基乙酰化形成的纖維素醋酸酯。由該物質(zhì)制成的薄膜稱(chēng)為醋酸纖維素薄膜。這種薄膜對(duì)蛋白質(zhì)樣品吸附性小，幾乎能完全消除紙電泳中出現(xiàn)的“拖尾”現(xiàn)象，又因?yàn)槟さ挠H水性比較小，它所容納的緩沖液也少，電泳時(shí)電流的大部分由樣品傳導(dǎo)，所以分離速度快，電泳時(shí)間短，樣品用量少，5靏的蛋白質(zhì)可得到滿(mǎn)意的分離效果。因此特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測(cè)。

　　醋酸纖維素膜經(jīng)過(guò)冰醋酸乙醇溶液或其它透明液處理后可使膜透明化有利于對(duì)電泳圖譜的光吸收掃描測(cè)定和膜的長(zhǎng)期保存。

　�、辈牧吓c試劑醋酸纖維素膜一般使用市售商品，常用的電泳緩沖液為pH8.6的巴比妥緩沖液，濃度在0.05-0.09mol/L。

　�、膊僮饕�點(diǎn)

　�、拍さ念A(yù)處理：必須于電泳前將膜片浸泡于緩沖液，浸透后，取出膜片并用濾紙吸去多余的緩沖液，不可吸得過(guò)干。

　　⑵加樣：樣品用量依樣品濃度、本身性質(zhì)、染色方法及檢測(cè)方法等因素決定。對(duì)血清蛋白質(zhì)的常規(guī)電泳分析，每cm加樣線(xiàn)不超過(guò)1靗，相當(dāng)于60-80靏的蛋白質(zhì)。

　�、请娪荆嚎稍谑覝叵逻M(jìn)行。電壓為25V/cm，電流為0.4-0.6mA/cm寬。

　　⑷染色：一般蛋白質(zhì)染色常使用氨基黑和麗春紅，糖蛋白用甲苯胺藍(lán)或過(guò)碘酸-Schiff試劑，脂蛋白則用蘇丹黑或品紅亞硫酸染色。

　�、擅撋�與透明：對(duì)水溶性染料最普遍應(yīng)用的脫色劑是5%醋酸水溶液。為了長(zhǎng)期保存或進(jìn)行光吸收掃描測(cè)定，可浸入冰醋酸：無(wú)水乙醇=30:70(V/V)的透明液中。

　　(二)凝膠電泳

　　以淀粉膠、瓊脂或瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳法稱(chēng)為凝膠電泳。其中聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)普遍用于分離蛋白質(zhì)及較小分子的核酸。瓊脂糖凝膠孔徑較大，對(duì)一般蛋白質(zhì)不起分子篩作用，但適用于分離同工酶及其亞型，大分子核酸等應(yīng)用較廣，介紹如下：

　�、杯傊�糖凝膠電泳的原理概述瓊脂糖是由瓊脂分離制備的鏈狀多糖。其結(jié)構(gòu)單元是D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤(pán)繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。因此該凝膠適合于免疫復(fù)合物、核酸與核蛋白的分離、鑒定及純化。在臨床生化檢驗(yàn)中常用于LDH、CK等同工酶的檢測(cè)。

　　⒉瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的基本技術(shù)在一定濃度的瓊脂糖凝膠介質(zhì)中，DNA分子的電泳遷移率與其分子量的常用對(duì)數(shù)成反比;分子構(gòu)型也對(duì)遷移率有影響，如共價(jià)閉環(huán)DNA>直線(xiàn)DNA>開(kāi)環(huán)雙鏈DNA。當(dāng)凝膠濃度太高時(shí)，凝膠孔徑變小，環(huán)狀DNA(球形)不能進(jìn)入膠中，相對(duì)遷移率為0，而同等大小的直線(xiàn)DNA(剛性棒狀)可以按長(zhǎng)軸方向前移，相對(duì)遷移率大于0。

　�、旁O(shè)備與試劑：瓊脂糖凝膠電泳分為垂直及水平型兩種。其中水平型可制備低濃度瓊脂糖凝膠，而且制膠與加樣都比較方便，故應(yīng)用比較廣泛。核酸分離一般用連續(xù)緩沖體系，常用的有TBE(0.08mol/l Tris·HCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/l EDTA)和THE(0.04mol/l Tris·HCl。pH7.8，0.2mol/L醋酸鈉，0.0018mol/l EDTA)。

　　⑵凝膠制備：用上述緩沖液配制0.5%-0.8%瓊脂糖凝膠溶液，沸水浴或微波爐加熱使之融化，冷至55℃時(shí)加入溴化乙錠(EB)至終濃度為0.5靏/ml，然后將其注入玻璃板或有機(jī)玻璃板組裝好的模子中，厚度依樣品濃度而定。注膠時(shí)，梳齒下端距玻璃板0.5-1.0mm，待脫凝固后，取出梳子，加入適量電極緩沖液使板膠浸沒(méi)在緩沖液下1mm處。

　　⑶樣品制備與加樣：溶解于TBE或THE內(nèi)的樣品應(yīng)含指示染料(0.025%溴酚藍(lán)或桔黃橙)、蔗糖(10%-15%)或甘油(5%-10%)，也可使用2.5%Fico Ⅱ增加比重，使樣品集中，每齒孔可加樣5-10靏。

　�、入娪荆阂话汶妷簽�5-15V/cm。對(duì)大分子的分離可用電壓5V/cm。電泳過(guò)程最好在低溫條件下進(jìn)行。

　�、蓸悠坊厥眨弘娪窘Y(jié)束后在紫外燈下觀察樣品的分離情況，對(duì)需要的DNA分子或特殊片段可從電泳后的凝膠中以不同的方法進(jìn)行回收，如電泳洗脫法：在紫外燈下切取含核酸區(qū)帶的凝膠，將其裝入透析袋(內(nèi)含適量新鮮電泳緩沖液)，扎緊透析袋后，平放在水平型電泳槽兩電極之間的淺層緩沖液中，100V電泳2-3小時(shí)，然后正負(fù)電極交換，反向電泳2分鐘，使透析袋上的DNA釋放出來(lái)。吸出含DNA的溶液，進(jìn)行酚抽提、乙醇沉淀等步驟即可完成樣品的回收。其它還有低融點(diǎn)瓊脂糖法、醋酸銨溶液浸出法、冷凍擠壓法等，但各種方法都僅僅有利于小分子量DNA片段(<1kb)的回收，隨著DNA分子量的增大，回收量顯著下降。

　　(三)等電聚焦電泳技術(shù)

　　等電聚焦(isoelectric focusing，IEF)是60年代中期問(wèn)世的一種利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。由于其分辨率可達(dá)0.01pH單位，因此特別適合于分離分子量相近而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)組分。

　�、盜EF的基本原理在IEF的電泳中，具有pH梯度的介質(zhì)其分布是從陽(yáng)極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質(zhì)分子具有兩性解離及等電點(diǎn)的特征，這樣在堿性區(qū)域蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷向陽(yáng)極移動(dòng)，直至某一pH位點(diǎn)時(shí)失去電荷而停止移動(dòng)，此處介質(zhì)的pH恰好等于聚焦蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)(pl)。同理，位于酸性區(qū)域的蛋白質(zhì)分子帶正電荷向陰極移動(dòng)，直到它們的等電點(diǎn)上聚焦為止。可見(jiàn)在該方法中，等電點(diǎn)是蛋白質(zhì)組分的特性量度，將等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場(chǎng)內(nèi)經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，各組分將分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)的pH位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。

　　⒉pH梯度的組成pH梯度的組成方式有二種，一種是人工pH梯度，由于其不穩(wěn)定，重復(fù)性差，現(xiàn)已不再使用。另一種是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或電泳管正負(fù)極間引入等電點(diǎn)彼此接近的一系列兩性電解質(zhì)的混合物，在正極端吸入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在負(fù)極端引入堿液，如氫氧化鈉、氨水等。電泳開(kāi)始前兩性電解質(zhì)的混合物pH為一均值，即各段介質(zhì)中的pH相等，用pH0表示。電泳開(kāi)始后，混合物中pH最低的分子，帶負(fù)電荷最多，pI1為其等電點(diǎn)，向正極移動(dòng)速度最快，當(dāng)移動(dòng)到正極附近的酸液界面時(shí)，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI1，這一分子不再向前移動(dòng)而停留在此區(qū)域內(nèi)。由于兩性電解質(zhì)具有一定的緩沖能力，使其周?chē)�一定的區(qū)域內(nèi)介質(zhì)的pH保持在它的等電點(diǎn)范圍。pH稍高的第二種兩性電解質(zhì)，其等電點(diǎn)為pI2，也移向正極，由于pI2>pI1，因此定位于第一種兩性電解質(zhì)之后，這樣，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)按各自的等電點(diǎn)依次排列，形成了從正極到負(fù)極等電點(diǎn)遞增，由低到高的線(xiàn)性pH梯度。

　�、硟尚噪娊赓|(zhì)載體與支持介質(zhì)理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)在pI處有足夠的緩沖能力及電導(dǎo)，前者保證pH梯度的穩(wěn)定，后者允許一定的電流通過(guò)。不同pI的兩性電解質(zhì)應(yīng)有相似的電導(dǎo)系數(shù)從而使整個(gè)體系的電導(dǎo)均勻。兩性電解質(zhì)的分子量要小，易于應(yīng)用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質(zhì)分開(kāi)，而且不應(yīng)與被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)或使之變性。

　　常用的pH梯度支持介質(zhì)有聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等，其中聚丙烯酰胺凝膠為最常應(yīng)用。

　　電泳后，不可用染色劑直接染色，因?yàn)槌Ｓ玫牡鞍踪|(zhì)染色劑也能和兩性電解質(zhì)結(jié)合，因此應(yīng)先將凝膠浸泡在5%的三氯醋酸中去除兩性電解質(zhì)，然后再以適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ旧��?

　　(四)其他電泳技術(shù)

　�、盜EF/SDS-PAGE雙向電泳法1975年O′Farrall等人根據(jù)不同組份之間的等電點(diǎn)差異和分子量差異建立了IEF/Sd S-PAGE雙向電泳。其中IEF電泳(管柱狀)為第一向，SDS-PAGE為第二向(平板)。在進(jìn)行第一向IEF電泳時(shí)，電泳體系中應(yīng)加入高濃度尿素、適量非離子型去污劑NP-40。蛋白質(zhì)樣品中除含有這兩種物質(zhì)外還應(yīng)有二硫蘇糖醇以促使蛋白質(zhì)變性和肽鏈?zhǔn)嬲埂?

　　IEF電泳結(jié)束后，將圓柱形凝膠在SDS-PAGE所應(yīng)用的樣品處理液(內(nèi)含SDS、-巰基乙醇)中振蕩平衡，然后包埋在SDS-PAGE的凝膠板上端，即可進(jìn)行第二向電泳。

　　IEF/ SDS-PAGE雙向電泳對(duì)蛋白質(zhì)(包括核糖體蛋白、組蛋白等)的分離是極為精細(xì)的，因此特別適合于分離細(xì)菌或細(xì)胞中復(fù)雜的蛋白質(zhì)組分。

　�、裁�細(xì)管電泳 Neuhoff等人于1973年建立了毛細(xì)管均一濃度和梯度濃度凝膠用來(lái)分析微量蛋白質(zhì)的方法，即微柱膠電泳，均一濃度的凝膠是將毛細(xì)管浸入凝膠混合液中，使凝膠充滿(mǎn)總體積的2/3左右，然后將其撳入約厚2mm的代用粘土墊上，封閉管底，用一支直徑比盛凝膠的毛細(xì)管更細(xì)的硬質(zhì)玻璃毛細(xì)管吸水鋪在凝膠上。聚合后，除去水層并用毛細(xì)管加蛋白質(zhì)溶液(0.1-1.0靗，濃度為1-3mg/ml)于凝膠上，毛細(xì)管的空隙用電極緩沖液注滿(mǎn)，切除插入粘土部分，即可電泳。