微生物實驗室的安全操作規(guī)程

　　1 實驗室安全

　　1.1 微生物實驗室的生物安全性

　　1.2 科室安全文檔

　　(a)生物危害防護(hù)：實際操作規(guī)程見(《實驗室生物安全通用要求》，中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB19489-2004。2004-01-05發(fā)布，2004-10-01實施。)

　　(b)實驗室安全：原則和措施見(《微生物和生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通用準(zhǔn)則》，中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS 233-2002。2002-12-03發(fā)布，2003-08-01實施。)

　　1.3 應(yīng)用：

　　以上的操作規(guī)程應(yīng)用于微生物科室的所有部門。工作人員或訪問人員必須遵守各項規(guī)定。

　　1.4 關(guān)于新規(guī)定或現(xiàn)行規(guī)定的修改案：

　　任何新規(guī)定或現(xiàn)行規(guī)定的修改案必須通知負(fù)責(zé)科室安全的人員及相關(guān)人員，他們將建議科室主任考慮實施。

　　1.5 生物性危害

　　1.5.1 與各種操作有關(guān)的生物危害水平取決于：

　　a.處理的傳染性物質(zhì)的本身：

　　按照傳染性物質(zhì)對個人和社區(qū)和潛在危險性以及經(jīng)空氣傳播的可能性，其劃分成不同等級。所采用的等級劃分詳見"《實驗室生物安全通用要求》";原則和措施(見《微生物和生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通用準(zhǔn)則》)。

　　b.使用的設(shè)備和設(shè)施：

　　處理不同等級的傳染性物質(zhì)的要求在"實驗室安全"中已規(guī)定。這些符合要求的設(shè)備都要承擔(dān)重要臨床工作，科室負(fù)責(zé)人必須保證中應(yīng)污染物水平。

　　c.培訓(xùn)，特別是員工的安全性培訓(xùn)和安全性經(jīng)驗積累。所有員工應(yīng)該接受一定訓(xùn)練，能安全處理任何實驗室可能碰到的物質(zhì)，避免將實驗不能處理或規(guī)定之外的傳染性物質(zhì)暴露在實驗室，即使暴露事故在實驗室，即使暴露事故發(fā)生也要會正確處理。

　　1.5.2 傳染性物質(zhì)的分類

　　1.5.2.1分類系統(tǒng)

　　生物危害防護(hù)：[見1.2 (a)]，根據(jù)生物因子對個體和群體的危害程度將其分為4級，危害等級Ⅳ最具危害性。

　　1.5.2.2危險群/生物安全水平：1-4

　　a.危險群/生物安全水平：1——對健康成人無致病性，對社區(qū)無危害性。通常一般微生物操作就足夠，不需特殊安全設(shè)備，工作的附近要有洗手設(shè)施。培養(yǎng)基上包含未鑒定物，因此，妥善處理對各級安全水平都至著重要。

　　b.危險群/生物安全水平：2——人類疾病相關(guān)物質(zhì)，這種物質(zhì)對實驗室工作人員有中度危險，并具有一定程度社區(qū)危險性。醫(yī)院微生物室所涉及的絕大多數(shù)物質(zhì)屬此安全水平，生物危害警告應(yīng)張貼，并且限制接近，應(yīng)用醒目標(biāo)語，若是能產(chǎn)生空氣傳播或飛濺的I，II類物質(zhì)都就使用相就的操作臺。實驗室就提供類似防護(hù)衣和手套，眼罩尤其是配戴隱形眼鏡者，也應(yīng)提供類似安全水平的洗手設(shè)施，并且臨近工作區(qū)也應(yīng)有高壓滅菌裝置。所有廢物和反復(fù)使用設(shè)備的去污染應(yīng)有特定的程序。

　　c.危險群/生物安全水平：3——人類疾病相關(guān)物質(zhì)，具有潛在空氣傳播性，能引起嚴(yán)重，致命疾病，對實驗室工作人員高度危險，并具有一定程度社區(qū)危險性。所有含有或懷疑含有生物案的標(biāo)本必須標(biāo)以"小心污染"標(biāo)簽，并且同時標(biāo)于盛放標(biāo)本容器和申清單。然而作為預(yù)防保護(hù)還不足夠。應(yīng)對所有血液，體液，分離的人體組織等有普通防護(hù)意識，它們都應(yīng)視作傳染源。在此生物安全級，實驗室應(yīng)控制對其接近。凡涉及該類物質(zhì)都應(yīng)使用I或II類工作臺操作，也可以遵循II級操作注意事項，對所有廢物進(jìn)行去污染處理，包括工作服和重復(fù)使用設(shè)備。

　　d.危險群/生物安全水平：4——對個人的危險如生物安全3級，但對社區(qū)有高度危險性。這些傳染性物質(zhì)包括：

　　蜱源性腦炎病毒

　　支里半亞-剛果牛血熱病毒

　　Marburg Virus

　　艾波拉病毒

　　Lagsa fever Virus

　　Junin HF Virus

　　Machupo HF Virus

　　Guanaruto HF Virus

　　Herpesvirus simiae (B Virus)

　　1.6 以下預(yù)防措施，所有實驗工作人員必須遵守：

　　1.6.1 工作服

　　a.所有實驗室成員在工作期間必須始終穿著所提供的工作服。離開實驗室時，工作服須掛在指定地方，不得在實驗室外冼工作服。

　　b.在處理含有或懷疑含有生物安全3級物質(zhì)的標(biāo)本時，必須在工作服外穿隔離衣。

　　c.在生物安全操作臺內(nèi)處理標(biāo)本和培養(yǎng)基時，必須戴手套。

　　1.6.2 洗手池

　　洗手池須供應(yīng)洗潔劑和紙巾。

　　1.6.3 洗手

　　所有工作人員在離開工作區(qū)必須洗手，并且要先脫去工作服和手套。

　　1.6.4 食物，飲水，吸煙，化妝品

　　食物和飲料不允許帶入任何處理標(biāo)本的房間.不允許在處理標(biāo)本的任何地方吸煙.不允許在處理標(biāo)本的任何地方使用化妝品。

　　1.6.5 傷口和擦傷

　　手上的傷口和擦傷必須覆蓋保護(hù)物。

　　1.6.6 個人衣物

　　個人衣物不允許帶入實驗室，并且必須保存在帶鎖的柜子里。

　　1.6.7 口吸移液管

　　這是禁用的。要求使用機(jī)械移液裝置。

　　1.7 常規(guī)預(yù)防措施應(yīng)用于所有血液、體液、組織標(biāo)本的操作中：

　　1> 無論何時都應(yīng)盡可能避免使用注射器，針頭或其它銳器。

　　2> 使用過的針頭和一次性切割器必須丟入專門的帶有蓋子和桶內(nèi)，以備安全處理、防止容器過滿盛裝。

　　3> 使用過的針頭不許重新使用或再用手操作。

　　4> 打爛的玻璃必須放入堅硬的容器(不要用手)，然后再放入黑色垃圾袋，如果是污染的，使用黃色垃圾袋。

　　5> 在接觸具有潛在性傳染性標(biāo)本培養(yǎng)基、組織，必戴保護(hù)性手套，防止皮膚直接接觸。如果手套有可見的污染，必須先除去污染，再更換。手上有皮炎或傷口的工作人員的需要間接接觸傳染性物質(zhì)的人員應(yīng)戴保護(hù)性手套。

　　6> 在處理完標(biāo)本、結(jié)束工作，甚至在上述規(guī)定帶手套時，應(yīng)常規(guī)洗手。

　　7> 當(dāng)血液、血液制品或其它體液污染發(fā)生時，應(yīng)停止工作洗手，戴一次性手套再清除污染區(qū)。建議用含有效氯1000ppm的次氯酸鈉溶液。如果污染區(qū)較大用浸有次氯酸鈉溶液的濕布覆蓋10min去污染，并標(biāo)示相應(yīng)的警告，丟棄廢物及手套到生物安全級物理容器。注意飛濺的水滴和流淌會將污染帶到主污染區(qū)以外。

　　8> 所有在實驗室使用的具有潛在污染性的物質(zhì)都需去污染，最好先高壓，再做處理。

　　9> 任何可能產(chǎn)生飛濺或氣霧的操作都應(yīng)在生物安全操作臺里進(jìn)行。這些操作包括離心，分離血清，混合，超聲，收集組織受精卵，以及處理含有濃集的感染物質(zhì)標(biāo)本。

　　1.8 實驗室物質(zhì)處理

　　a> 黑色塑料袋用來收集未污染或經(jīng)高壓過需處理的廢物。

　　b> 廢紙屢用來收未污染的廢紙，用過的紙巾等。

　　c> 所有可能傳染的物質(zhì)必須高壓或焚化。

　　d> 所有丟棄的標(biāo)本，培養(yǎng)基和實驗室廢物必須放在專門容器里

　　e> 用白色聚丙烯罐盛裝2%新鮮配置次氯酸液，以供工作中丟棄標(biāo)本，污染吸頭，棉拭子臨時處理待一天工作結(jié)束之后，再經(jīng)高壓處理。

　　f> 黃色塑料袋用來處理污染的實驗室廢物。它們應(yīng)封口再由工人拿去焚燒。

　　g> 帶蓋，帶標(biāo)簽硬質(zhì)容器用來盛裝針頭的銳器。

　　1.9 實驗室傳染性物的消毒

　　高壓

　　a.所有培養(yǎng)基的傳染性物質(zhì)都要高壓，除非準(zhǔn)備焚燒的，高壓的最大好處是使傳染性物質(zhì)離開實驗室可保證安全。

　　b.用作此目的的高壓設(shè)備應(yīng)在醫(yī)學(xué)技師監(jiān)督下由實驗室工人操作。

　　c.高壓設(shè)備應(yīng)定期由醫(yī)院設(shè)備組測試，檢修。這些測試包括商業(yè)使有的芽胞試紙實驗。多個高壓設(shè)備應(yīng)有使用記錄，并自使用之日起由醫(yī)學(xué)技師連續(xù)記錄。任何不符都要向安全人員報告。

　　1.10 去污染

　　去污染劑：

　　1> 次氯酸溶液：用白色聚丙烯罐裝新鮮配置的含有效氯1000ppm的2%次氯酸溶液，放在多個工作室。

　　2> 5%的Printol：其50%水溶液用來處理濺在地板和家具上的污染。

　　3> 戊二醛：新鮮配制成一定濃度，主要用于不能使用次氯酸鈉的儀器去污染，如離心機(jī)等。

　　4> 75%乙醇：主要用于對清潔表面的快速去污染。

　　1.11 離心機(jī)

　　1.11.1 注意事項：

　　a> 使離心機(jī)用的試管應(yīng)具是厚管或塑料的，離心前應(yīng)仔細(xì)檢查是否缺損。

　　b> 離心機(jī)需放置在合適的位置，操作都應(yīng)能看見離心缸，以便能正確地將離心架放在轉(zhuǎn)子上。

　　c> 離心桶和離心架配對使用，負(fù)載后需仔細(xì)平衡。

　　d> 為避免脫架和試管內(nèi)溶液濺出，開始采用低轉(zhuǎn)速，然后逐漸升高。

　　e> 離心機(jī)內(nèi)缸應(yīng)由高級人員定期檢索，內(nèi)壁必須用戊二醛定期清潔，去污染。

　　f> 在對含有或懷疑含有生物安全操作3級標(biāo)本離心時，必須加蓋密封，密封蓋只有在一級生物安全操作臺內(nèi)才能打開。

　　1.11.2 離心時，試管破裂

　　a> 如果正在離心時，發(fā)生或懷疑發(fā)生試管破裂，電動機(jī)應(yīng)立即斷電，并在30min后才能打開離心機(jī)蓋。

　　b> 如離心后發(fā)現(xiàn)破裂，應(yīng)立刻關(guān)閉機(jī)蓋，保持至少30min。

　　c> 立即通知安全員。

　　d> 戴厚手套，使用鑷子或用鑷子夾棉鑒清除破碎玻璃碎片。

　　e> 所有破裂試管，玻璃碎片，離心桶和轉(zhuǎn)子必須放在專門消毒劑中去污染，要求消毒劑不具腐蝕性，對浸生物安全物質(zhì)有效。然后，或者浸泡至24小時，或者高壓。

　　f> 未破裂，帶蓋的試管也應(yīng)放在另一含有消毒劑的容器中1后，再對其內(nèi)容物處理。

　　i> 離心缸必須用戊二醛棉拭子清潔，過夜，再重復(fù)擦拭，再用水清潔洗凈并干燥。

　　g> 含有生物安全3級物質(zhì)的密封離心桶必須在密封狀態(tài)下取出，在一級生物安全操作臺內(nèi)打開。如果試管破裂，離心桶密封蓋應(yīng)松松地蓋上，對離心桶高壓。

　　1.12 破裂和溢出

　　任何重要的破裂的溢出都應(yīng)通知安全人員。在處理含有或懷疑含有生物案例的溢出物，應(yīng)先得到安全人員的建議。

　　1.12.1 病毒培養(yǎng)基的泄漏

　　a> 用浸有20%次氯酸鈉的紙巾覆蓋濺灑出的污染物用容器碎片。

　　b> 覆蓋10-15min。

　　c> 戴一次性手套，清掃紙巾和碎片于合適的容器(如塑料袋，但不包括含有碎玻璃或其它銳利物體)，用一片硬紙板去清掃，不能用刷子或塵撣，除非它們適于高壓。手指遠(yuǎn)離碎玻璃。

　　d> 將碎片和使用后的廢物放在實驗室廢物箱。

　　e> 用常規(guī)工作消毒劑擦拭污染區(qū)及其周圍可能飛濺區(qū)。

　　1.13 泄漏的標(biāo)本

　　實驗室不泄漏的標(biāo)本，但要以塑料密封后退還到病房。

　　1.14 紫外線消毒：培養(yǎng)基，試劑分裝和病人血清應(yīng)存放-70°C和-30°C冰箱。操作存放于-30°C或以下溫度冰箱物質(zhì)，應(yīng)戴手套，例如當(dāng)標(biāo)本從低溫冰箱取出或放入時。

　　1.15 生物安全柜(臺)

　　實驗室應(yīng)配備II級生物安全柜。

　　1.15.1 級別

　　I ：基本要求：定向流動保護(hù)，要求氣流從外流入安全柜，并且遠(yuǎn)離操作者，指向傳染物。經(jīng)HEPA過濾排后，緊好由導(dǎo)管引向室外，以便清除去污染后的各種蒸汽。

　　II：基本要求：經(jīng)過濾氣體垂直流向，既保護(hù)操作者也要保護(hù)工作不受污染。

　　IIA：70%的過濾氣體重新循環(huán)至工作區(qū)，廢氣導(dǎo)向室外經(jīng)HEPA過濾。和內(nèi)流經(jīng)式工作區(qū)的氣流速度平均0.4m/s或略高。

　　IIB：流進(jìn)氣體流速平均0.5m/s或更好。按照不同型別(IIB1，IIB2，IIB3)，氣體排出比例從70%到100%。根據(jù)工作選擇不同型。如有毒化學(xué)物質(zhì)和放射線同位素不能再循環(huán)至工作區(qū)。

　　III ：基本要求：操作者與傳染物安全隔離，并且整個操作過程都要提高。安全柜所在的環(huán)境也要一定程度隔離，以防手套破裂。

　　1.15.2 生物安全柜的安裝

　　安全柜要發(fā)揮某安全防護(hù)功能必須注意安裝位置，廢氣應(yīng)通過管道以保護(hù)環(huán)境不受污染。如果需購置這類設(shè)備應(yīng)聯(lián)系CUHK安全辦公室，在種類，牌子，樣式，安裝位置和安裝以及與其它設(shè)施的相鄰關(guān)系上獲得指導(dǎo)。

　　1.15.3 常規(guī)檢查和安全操作以及工作區(qū)的消毒

　　有一份操作規(guī)程詳盡地敘安全柜的常規(guī)使用也應(yīng)包括安全柜發(fā)生意外時應(yīng)采取的行動。每一個使用者必須閱讀規(guī)程使后簽名。

　　1.15.4 注意：

　　安全柜應(yīng)盡可能避免使其處于不安全狀態(tài)，但有時因為安全柜的意外，使用者被迫這樣做。此時，應(yīng)張貼注意以警告其它人不得再使用。

　　1.15.5 去污染和再認(rèn)證

　　由受過訓(xùn)練的人員,配戴個人防護(hù)用具,來做污染工作。要求：安全柜在密閉條件下用干燥多聚甲醛蒸汽醺蒸，使用濃度8500ppm。(安全柜的體積應(yīng)包括外周供應(yīng)和廢氣過濾設(shè)備。)在溫度20-25°c，相對溫度不低于60%環(huán)境保持4h，甲醛蒸汽，如果允許，可直接抽出室外，若不允許可在安全柜內(nèi)用氨基重碳鹽吸收。

　　因為空氣有限的穿透力，在處理潛在傳染性物質(zhì)時最好使用HEPA過濾器，以及高壓或焚化后再丟棄。

　　1.17.5.2 再認(rèn)證

　　這項工作由專門人員進(jìn)行，去污染后安全柜性能再認(rèn)證定，及過濾器的更換，測試是否有漏氣，調(diào)試空氣流速是否合規(guī)定，以及檢測過濾器的性能。再認(rèn)證應(yīng)至少一年做一次，或是裝置移動，過濾器維修后。應(yīng)備有去污染，維修和再認(rèn)證的記錄，并且應(yīng)方便使用者的查閱。

　　2. 實驗安全操作程序：

　　2.1 工作人員在采集標(biāo)本過程中應(yīng)當(dāng)防止病原微生物擴(kuò)散和感染，并對標(biāo)本的來源、采集過程和方法等作詳細(xì)記錄。

　　2.3 實驗過程中絕對禁止吸煙、飲食等，不要以手撫頭面部等。

　　2.4 處理樣本的過程中易產(chǎn)生高危害氣溶膠時，要求同時使用適當(dāng)?shù)膫�人防護(hù)裝備、生物安全柜和/或其它物理防護(hù)設(shè)備。如可產(chǎn)生含生物因子的氣溶膠，應(yīng)在適當(dāng)?shù)纳�物安全柜中操作。�?xì)菌的分離培養(yǎng)、菌種開封、轉(zhuǎn)種、研磨、稀釋等操作，均應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行。

　　2.5 使用接種環(huán)進(jìn)行操作時，接種環(huán)應(yīng)在工作燈的內(nèi)焰中燃燒，以避免菌液或菌塊飛濺。

　　2.6 稀釋菌液時，吸管、針管要緩慢插入試管或燒瓶底部，小心操作避免產(chǎn)生氣泡或氣溶膠。

　　2.7 使用注射器加樣時，用過的針頭切勿再重新入套或拔開注射器與針頭，應(yīng)直接放入銳器收集器，以免劃破皮膚造成接種感染。

　　2.8 菌株庫要設(shè)專人管理，并按照國家微生物菌毒種管理辦法執(zhí)行。2.9進(jìn)行毒菌操作過程中，不要穿戴巳經(jīng)污染的防護(hù)性手套觸摸門柄、儀器或毒菌區(qū)以外區(qū)域，避免由于粗心擴(kuò)大污染范圍。

　　2.10 試驗結(jié)束后，操作過程中所有可能與生物危險物接觸或被污染的試驗器械和物品，能夠高壓消毒的必須高壓消毒，不能進(jìn)行高壓消毒的設(shè)備、儀器，應(yīng)使用有效的消毒劑擦洗后再以紫外燈近距離長時間消毒。

　　2.11 實驗中發(fā)生意外污染情況，應(yīng)立即通知主管人員并做好處理污染物和相應(yīng)區(qū)域的準(zhǔn)備，不得擅自采用其它禁止的方法進(jìn)行消毒處理。

　　2.12 實驗室內(nèi)任何微生物的樣本，廢棄物都必須經(jīng)高溫高壓滅菌后，方可按一般垃圾處理。

　　2.13 實驗室所用任何個人防護(hù)裝備應(yīng)符合國家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求。實驗室應(yīng)確保具備足夠的有適當(dāng)防護(hù)水平的清潔防護(hù)服供使用。還應(yīng)穿戴其它的個人防護(hù)裝備，如手套、防護(hù)鏡、面具、頭部面部保護(hù)罩等。

　　3. 實驗室污物處理及消毒操作程序：

　　3.1 實驗室含有生物危險物的臨床標(biāo)本及被污染的一次性用品，試驗完成后，應(yīng)在操作臺或?qū)嶒瀰^(qū)域內(nèi)以紫外燈近距離照射消毒 2小時以上，再經(jīng)高壓消毒后方可丟棄或焚燒。

　　3.2 可重復(fù)使用的實驗用品及器材，完成實驗后，應(yīng)在操作臺或?qū)嶒瀰^(qū)域內(nèi)經(jīng)紫外燈近距離照射消毒2小時以上后，再交有關(guān)人員進(jìn)行高壓消毒和煮沸洗刷。

　　3.3 實驗用的試管、吸管、注射器，須裝在加蓋不漏的容器內(nèi)，經(jīng)高壓滅菌后取出。

　　3.4 培養(yǎng)物或?qū)嶒炇依�圾，在丟棄前必須經(jīng)高壓消毒和紫外燈近距離長時間照射處理。不允許積存垃圾和實驗室廢棄物。已裝滿的容器應(yīng)定期運走。在去污染或最終處置之前，應(yīng)存放在指定的安全地方，通常在實驗室區(qū)內(nèi)。

　　3.5 實驗室廢棄物應(yīng)置于適當(dāng)?shù)拿芊馇曳缆┤萜髦邪踩�運出實驗室。有害氣體、氣溶膠、污水、廢液應(yīng)經(jīng)適當(dāng)?shù)臒o害化處理后排放，應(yīng)符合國家相關(guān)的要求。

　　3.6 實驗過程中，如標(biāo)本或含標(biāo)本的前消化處理液被打翻污染了操作臺或地面，應(yīng)以吸滿70%酒精的衛(wèi)生紙覆蓋污染區(qū)，15分鐘以后衛(wèi)生紙方可移去。

　　3.7實驗室內(nèi)未經(jīng)消毒的污水，禁止直接排入公共排水系統(tǒng)，更不允許混入居民生活垃圾。

　　4. 意外事故處理程序：

　　4.1 如果發(fā)生意外，必須立即通知實驗室主管人員和醫(yī)院生物安全辦公室，并在有關(guān)人員的指導(dǎo)監(jiān)督下對出事現(xiàn)場進(jìn)行處理，絕對禁止未經(jīng)報告而私自對出事現(xiàn)場給予非規(guī)范的處理。

　　4.2 實驗過程中，如污染物濺落到身體表面，或有割傷、刺傷、燒傷、燙傷等情況發(fā)生，應(yīng)立即停止實驗工作進(jìn)行緊急處理，更換被污染的實驗服，皮膚表面用消毒液清洗，傷口以碘酒或酒精消毒，眼睛用無菌生理鹽水沖洗。

　　4.3 如果發(fā)生菌液溢出，含菌種的培養(yǎng)管破碎等，造成中 、小面積污染，可用比污染面積大25%以上的紗布覆蓋污染區(qū)域，邊緣用脫脂棉圍住，向紗布傾倒5%苯酚溶液或70%的酒精，浸泡2小時以上(其間適量加溶液防止干燥)，再經(jīng)紫外燈近距離(1米內(nèi))照射2小時以上;被污染的器械、容器等立即浸泡于70%酒精中2小時以上，再次著防護(hù)衣進(jìn)入房間，將污染溢出物和用于清潔的紗布放入可耐受高壓的雙層塑料袋內(nèi)并盡快高壓。

　　4.4 如果發(fā)生氣溶膠污染或大面積污染，應(yīng)立即停止實驗并關(guān)閉實驗室，對污染區(qū)域進(jìn)行紫外燈照射消毒過夜;第二天對污染區(qū)進(jìn)行24小時封閉空氣熏蒸消毒(乙醛消毒法﹕5ml乙醛+2g高錳酸鉀/m3空間)。

　　4.5 臨床醫(yī)務(wù)人員應(yīng)對事故受害者和消毒人員進(jìn)行醫(yī)學(xué)隨訪。